作者开发了一种生物功能化的可溶性水凝胶微珠(SNAP beads)技术，用于高效纯化和表征天然蛋白质复合物，特别是在低样本量条件下。
蛋白质复合物的表征对理解生命过程中的分子机制至关重要。尽管冷冻电镜和非变性质谱等技术慢慢的提升，但在低样本量下捕获非共价复合物并分析其组成仍是一个重大挑战。传统的亲和纯化方法在捕获目标蛋白后，常常要通过竞争性洗脱来释放蛋白，但配基与目标蛋白的高亲和力常常会阻碍非变性条件下的洗脱，导致回收效率降低。因此，开发一种适用于小样品规模的高效纯化技术变得尤为迫切。低丰度靶标蛋白的纯化往往需要大量样本和繁琐的洗脱步骤，而替代方案如通过靶蛋白或纯化基质上的linker断裂，也因配基装载密度和目标蛋白在beads上的可及性等问题，效果不尽人意。同时，天然样本中广泛存在的糖基化等复杂修饰造成蛋白质复合物的高异质性，使其谱学信号难以解析。为解决这样一些问题，研究人员开发了SNAP-MS技术，该技术将生物功能化的可溶性水凝胶微珠和非变性串联质谱结合，明显提升了从低丰度样本中纯化和表征天然蛋白质复合物的效率，并在纯化步骤引入了解决糖蛋白信号问题的配合分子，为生物大分子研究提供了新的高效工具。
SNAP-MS技术的核心在于开发了一种生物功能化的可溶性水凝胶微珠（SNAP beads），在捕获目标蛋白复合物后，能够最终靠化学试剂或光学处理使亲和珠完全溶解，从而释放目标物至溶液中。这种方法避免了传统亲和纯化中的竞争性洗脱步骤，允许使用高亲和力的配基实现高特异性、高回收率、高浓度的富集纯化。此外，SNAP-MS技术还能够与非变性质谱兼容，提供包括结合化学计量比、拓扑结构和蛋白质异质体分布和蛋白互作界面等结构信息。通过消除洗脱液、微珠间的空隙以及微珠的吸附表面，最大限度减小了纯化体系的产物体积。这些特性使得对多种pmol量级蛋白质进行纯化成为可能。在质谱分析的过程中，附着在靶标蛋白上配基的能够最终靠气相中的碰撞诱导解离释放。利用配基分子的确定质量和释放时的非对称电荷分配效应，可以明显提高分析异质性糖蛋白及其复合物的准确性。作为一种多功能策略，SNAP-MS即可以独立实施，也可以与传统工具（如冷冻电镜）联合使用，以对各种天然蛋白质复合物进行更详细的结构表征。
SNAP-MS技术很适合从血液等生物样本中纯化和表征内源性蛋白质复合体，包括具有异质性的糖蛋白。血红蛋白结合蛋白（Hp）是一种血浆蛋白，能够与溶血时红细胞释放的血红蛋白（Hb）结合，其表达分布与多种疾病进行具有关联性。Hp在多肽链长度、糖基化、寡聚态和结合状态方面表现出显著的异质性（图2a）。在本研究中，研究者利用以Hb为配基的SNAP亲和珠从四个志愿者的血清中纯化Hp，并以Hp-Hb复合体的形式回收，这证明了SNAP-MS技术能够有效分离健康供体血清中的Hp-Hb复合体，为临床相关研究提供了一种新方法。不同供体血清中捕获的Hp在SDS-PAGE中的总丰度不同，在非变性质谱中表现出个体特有的寡聚态分布模式，揭示了Hp寡聚态在个体间的差异（图2b）。通过在血清样本中引入自由Hb模拟溶血条件，非变性质谱清晰地揭示了Hp-Hb复合体中Hb的占据情况（图2c）。由于linker断裂后部分附加到配基Hb导致Hb亚基质量增加了126 Da，这个质量增加作为质量标签，使得在串联质谱中从配基Hb-Hp复合物释放Hb时能够区分配基Hb和血浆Hb（图2d）。未经处理的血清样本中未检测到未修饰的Hb β链，而在引入模拟溶血剂后检测到，表明复合体中不存在内源性Hb。对于Hp而言，链长、寡聚化状态、糖基化和结合状态的高异质性导致了质谱图谱的复杂化。由于不同电荷状态下信号重叠严重以及质量轮廓不一致，利用传统解卷积算法很难处理高异质性糖基化Hp的MS1图谱，并难以准确测定其质量和结合计量比。在SNAP-MS流程中，配基分子在捕获目标蛋白后仍然附着在目标蛋白上，可当作电荷移除器和质量校正器，以帮助准确确定目标蛋白的质量与化学计量比。通过串联质谱中的碰撞解离，配基分子Hb亚基从配基-目标蛋白复合物中解离，携带多个电荷，以此来降低作为解离产物的Hp-Hb复合物离子的电荷密度（图2e）。离子价态的降低提升了了各价态信号分辨率和对m/z读数不确定性的容忍度，来提升了质量/电荷测定的准确性。同时，由于配基的质量已知，可借助解离反应的质量守恒作为约束条件，校正使用传统算法测定目标蛋白引起的质量误差。
图2. SNAP-MS技术用于血浆中血红蛋白结合蛋白（Hp）的纯化和表征
SNAP-MS技术不仅仅可以快速高效地纯化目标复合物，还能在纯化后立即表征其完整性、亚单位组成和拓扑结构。这可为研究蛋白质复合物的完整性和降解过程提供实时信息，包括它们的解离和重排情况。因此，SNAP-MS在筛选蛋白质表达和样品制备的最佳方案方面提供了显著优势，可提升传统结构生物学工具如冷冻电镜（cryo-EM）的数据质量，并优化工作流程。在本研究中，作者利用SNAP-MS技术对不同实验方案表达所得的抗降解稳定性呈现差异的20S蛋白酶体进行了快速筛选（图3a）。研究之后发现，当两个亚基在同一质粒中编码表达时，完整的二十八聚体20S复合物相对重排产物的丰度比例更高，呈现更高的稳定性（图3d-e）。经过SNAP-MS筛选条件后，作者选择了含有最高丰度完整20S的样本做冷冻电镜（EM）分析。由于聚丙烯酰胺聚合物在EM下信号微弱，溶解了捕获目标蛋白的SNAP亲和珠后，能够直接将溶解产物转移到冷冻电镜网格上表征目标复合物，无需去除凝胶聚合物。得益于20S的高完整性，作者成功重建了20S的3D结构，分辨率达到3.16 Å（图3f）。
SNAP-MS技术在提高纯化效率、保持蛋白质复合物的天然状态和解析高度异质性的蛋白质复合物方面具有非常明显优势。这项技术不仅仅可以提供蛋白质复合物的多层次结构信息，还能用来筛选优化表达及前处理条件，从而提升下游分析的效率和数据质量。总之，这项研究开发的SNAP-MS技术为天然蛋白质复合物的高效分析提供了一种新的方法，有望在生物过程分子机制的揭示和临床指标的细化中发挥及其重要的作用。
